我終於知道師兄做細胞分選，爲啥又快又好了（含試用）

調節性 T 細胞（Treg）在預防自身免疫、維持免疫系統穩態和對自身抗原的耐受性中發揮着重要作用，利用 Treg 的抑制活性進行臨牀治療也是一個主要的研究領域。其在治療自身免疫性疾病、預防移植排斥、癌症免疫治療、過敏反應以及應對傳染病方面具有巨大的潛力。

不過 Treg 細胞雖然熱門，但細胞分選還是有點難做的！這不，師姐做完 Treg 細胞的體外功能實驗，課題就差臨門一腳時，意外發生了……

師姐

真是水逆，實驗數據一直不穩定。一時不知是分選的 Treg 細胞活性不好？純度不夠？還是存在其他因素干擾？怎麼辦啊？

別糾結那麼多了。我看隔壁組有人用CD4+CD304+ 磁珠分選，效果不錯，還可解離磁珠，無需耗時的清洗步驟，你可以試試。

師兄

聽了師兄的推薦，是否有所動心？免費試用的機會來啦！STEMCELL 研發並推出了以CD304 爲靶向標誌物的分選試劑盒EasySep™ Release 小鼠 CD4+CD304+ 調節性 T 細胞分選試劑盒（產品號 #100-1570，點此可免費申請試用），其可簡單、快速地從小鼠脾細胞或淋巴結中分離出 CD4+CD304+（胸腺來源或天然）調節性 T 細胞，只需 45 分鐘，純度達 94%，並且還可從同一樣本中分離出 CD4+CD304- 應答 T 細胞以進行功能分析（如 Treg 抑制分析）。

接下來，讓我們一起深入瞭解 Treg，全面掌握其免疫抑制機制、標誌物以及分選注意事項！

知己知彼：Treg 的那些事

01

Treg 的免疫抑制

Treg 可通過多種免疫抑制機制來維持免疫耐受，防止免疫系統攻擊自身組織：

通過高親和力 IL-2R（CD25）清除 IL-2：IL-2 是 T 細胞增殖和激活所必需的細胞因子，Treg 細胞高表達 CD25，即 IL-2 受體的 α 鏈，從而使其能夠結合並清除 IL-2 並有效地抑制 T 細胞的擴增和活性。

分泌抗炎細胞因子：Treg 可分泌抗炎細胞因子，如 IL-10、TGF-β 和 IL-35，這些細胞因子能夠抑制炎症反應，減輕免疫反應強度。

通過穿孔素 / 顆粒酶殺死自身反應性細胞：Treg 細胞可以通過細胞毒性機制直接殺死自身反應性細胞（靶向自身抗原的細胞）。

CTLA-4 抑制性受體阻斷 CD28 激活：CTLA-4 是 Treg 細胞表達的抑制性受體，其與 CD28（T 細胞激活所需的共刺激受體）結合相同的配體，可阻斷 T 細胞激活所需的共刺激信號，從而有效地抑制免疫反應。

PD-1 抑制自身反應性 B 細胞：PD-1 是 Treg 細胞表達的另一個抑制性受體，其可以抑制 T 細胞，且在抑制自身反應性 B 細胞中發揮作用。通過與 B 細胞上的配體 PD-L1 相互作用，PD-1 可以抑制 B 細胞激活和抗體產生。

細胞外腺苷介導的免疫抑制：Treg 細胞表達 CD39 和 CD73 等酶，這些酶將 ATP 轉化爲腺苷。腺苷是一種免疫抑制分子，可以抑制 T 細胞激活並促進 Treg 細胞功能。

圖 1 Treg 介導的免疫抑制機制

02

Treg 的標誌物

目前仍未發現有唯一的細胞表面標誌物可以特定識別 Treg。隨着研究發現細胞內轉錄因子 FOXP3 是主要控制 Treg 發育和功能的關鍵基因，目前Treg 的「標準」表型被確定爲 CD4+CD25+FOXP3+。

Treg 的亞羣Treg 可分爲兩種主要的亞羣：

胸腺來源（或天然）Treg：這些 Treg 細胞在胸腺中發育，並從兩個不同的 CD4 單陽性祖細胞亞羣（CD25+FOXP3- 或 CD25-FOXP3low）分化而來，天然 Treg 細胞被認爲是中央耐受的主要介導者，防止自身反應性 T 細胞在胸腺中發育。

外周來源（或誘導）Treg：這些 Treg 細胞在外周淋巴組織中產生（例如淋巴結和脾臟），在外周抗原刺激 naïve T 細胞後誘導產生。誘導性 Treg 細胞在外周耐受中起着至關重要的作用，可抑制對外來抗原的免疫反應，並防止外周的自身免疫反應。

小鼠 Treg 通常以 CD4+CD25+ 作爲表型。此外，CD4+CD45RBlow 細胞羣是另一類小鼠 Treg，在維持免疫穩態和抑制自身免疫反應中發揮着關鍵作用。對人 Treg 而言，大多數以 CD4、CD25 和轉錄因子 FOXP3 作爲標誌物。CD127 是 IL-7 受體，其在成熟 T 細胞上表達，對增殖和分化具有十分重要的作用。然而，CD127 在人 Treg 中的表達較低或不表達，且與 FOXP3 水平呈負相關。因此，CD127 可作爲人 Treg 特徵標誌物與活化的 T 細胞進行區分。

神經纖毛蛋白 - 1（Nrp-1 或 CD304）的表達與 CD25 密切相關，並且可以區分小鼠胸腺來源（天然）Treg 和誘導性 Treg。天然 Treg（nTregs）通常高表達 CD304，而誘導性 Treg（iTregs）通常低表達或不表達 CD304。此外，CD304 在增強 Treg 與樹突狀細胞（DCs）的相互作用中起着至關重要的作用，其可與 DCs 上的 Sema4A 結合，穩定 Treg 與 DCs 的相互作用。

03

Treg 的分選

在進行 Treg 分選時，通常以 CD4 和 CD25 作爲標誌物，其充分利用 Treg 上 CD25 的高表達來富集 FOXP3+ 細胞。然而靶向 CD25 可能會干擾 Treg 中的 IL-2 信號傳導，影響下游的功能實驗。因此，分選時以 CD304 爲靶向標誌物，而非 CD25（IL2RA），可避免對Treg 中 IL-2 信號傳導的干擾，從而能夠確保維持 Treg 的功能。

EasySep™ Treg 試劑盒首先通過正選 CD304+ 細胞，然後在一個步驟中同時去除磁珠和非 CD4+ 細胞，最終分選後的細胞中含有高表達 FOXP3 和 CD25 的 CD4+CD304+ 細胞，並且不含磁珠，可立即用於下游應用，如流式細胞術、細胞培養或 DNA/RNA 提取等。

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產品優勢：

● 在 45 分鐘內獲得純度高達 94% 的 CD4+CD304+ 細胞；

● 獲得無磁珠且具有功能性的 CD25high Treg，且不會干擾 IL-2 信號傳導；

● 使用 EasySep™ Release RapidSpheres™ 可解離磁珠，無需耗時的清洗步驟；

● 可從同一供體中分離出 CD4+CD304- 應答 T 細胞。

產品數據：

圖 2 使用 EasySep™ Release 小鼠 CD4+CD304+ 調節性 T 細胞分選試劑盒分離無磁珠標記的小鼠 CD4+CD304+ 天然調節性 T 細胞和應答 T 細胞的操作流程

圖 3 EasySep™ Release 小鼠 CD4+CD304+ 調節性 T 細胞分選試劑盒可分離出高純度的 CD4+CD304+ 細胞，這些細胞可高表達 Treg 標誌物 FOXP3 和 CD25

（A）起始樣本爲 naïve 小鼠脾細胞，分選後的 CD4+CD304+ T 細胞通常爲 90.4 ± 3.0%，CD4+CD304+CD25hiFOXP3+ 細胞爲 71.0 ± 4.6%（平均值 ± 標準差；使用「Big Easy」EasySep™ 磁極）。在上述示例中，起始樣本和最終分選後的 CD4+CD304+ 細胞純度分別爲 3.0% 和 90.2%；CD4+CD304+CD25hiFOXP3+ 細胞爲 1.9% 和 73.0%。

（B）起始樣本爲 naïve 小鼠淋巴結，分選後的 CD4+CD304+ T 細胞通常爲 92.1 ± 0.7%，CD4+CD304+CD25hiFOXP3+ 細胞爲 78.1 ± 1.4%（平均值 ± 標準差；使用「Big Easy」EasySep™ 磁極）。在上述示例中，CD4+CD304+ 細胞的起始和最終分選後的純度分別爲 5.4% 和 92.3%；CD4+CD304+CD25hiFOXP3+ 細胞分別爲 4.0% 和 77.1%。

（C）起始樣本爲 naïve 小鼠脾細胞，分選後的 CD4+CD304- 應答 T 細胞通常爲 94.1 ± 2.9%，CD4+CD304-CD25-FOXP3- 細胞爲 90.6 ± 3.0%（平均值 ± 標準差；使用「Big Easy」EasySep™ 磁極）。

在上述示例中，CD4+CD304- 細胞的起始和最終分選後的純度分別爲 11.9% 和 95.4%；CD4+CD304-CD25-FOXP3- 細胞分別爲 11.4% 和 94.4%。

內容策劃：沈佳鈺

內容審覈：吳軍

文中圖片來源：STEMCELL

題圖來源：自制