疫苗前沿 | 病毒樣結構用於組合抗原蛋白mRNA疫苗接種

摘要：改進的疫苗接種需要更好地傳遞抗原並激活自然免疫反應。在這裡，我們報告了一種脂質納米顆粒系統，該系統具有攜帶包括mRNA和蛋白質在內的抗原的能力，通過表面裝飾有刺突蛋白形成病毒樣結構，展示了對SARS-CoV-2變體的應用。該策略使用Omicron BA.1上的S1蛋白在表面傳遞XBB.1的S1蛋白mRNA。病毒樣顆粒通過表面S1蛋白與ACE2或DC-SIGN受體的相互作用，能夠在人類呼吸道上皮細胞和巨噬細胞中特異性增強mRNA的表達。通過相同的受體結合，展示了巨噬細胞和樹突狀細胞的激活。與單獨的mRNA和蛋白質疫苗相比，蛋白質和mRNA的結合在BALB/c小鼠中增加了抗體反應。我們對這種強大免疫機制的探索表明，它可能涉及交叉呈遞給從激活的先天免疫信號到適應性免疫信號的不同亞羣的樹突狀細胞。

1.引言

自2019年底由嚴重急性呼吸綜合徵冠狀病毒2（SARS-CoV-2）引起的2019冠狀病毒病（COVID-19）大流行開始以來，已經開發並上市了多種針對該疾病的疫苗。然而，這些疫苗的應用並未完全限制大流行的傳播，流行病學調查中發現的抗體水平顯示出有限的持續時間和對病毒變種的低效性。這些發現表明，SARS-CoV-2與宿主免疫系統之間的相互作用在很大程度上尚不清楚，需要開發新型疫苗。幸運的是，基於脂質納米遞送系統的成功開發，mRNA疫苗取得了突破性進展，提供了新的技術可能性。通過人工脂質膜與細胞質膜的融合，將編碼抗原的mRNA通過脂質納米顆粒（LNP）傳遞到細胞內，可在細胞內有效表達病毒刺突蛋白（S蛋白）抗原，並誘導隨後的S抗原呈遞，通過樹突狀細胞（DCs）和巨噬細胞激活先天/適應性免疫。

根據病毒免疫學研究，在細胞內病毒複製過程中產生的結構和/或非結構抗原可以被先天免疫系統的細胞模式識別受體在宿主免疫反應的抗原信號刺激的首次事件中識別。這意味着mRNA具有通過這種自然免疫途徑引發免疫反應的優勢；其策略在某種程度上類似於膜狀病毒SARS-CoV-2的感染機制，儘管活病毒通常利用病毒膜中的S蛋白與細胞膜中的ACE2受體特異性結合以實現病毒基因組的內化。

因此，當脂質遞送顆粒在其表面裝載S蛋白時，這些脂質顆粒可能具有類似病毒的結構（VLS），通過受體靶向細胞。特別是，SARS-CoV-2的S蛋白被發現與DC和巨噬細胞表面表達的ACE2或DC-SIGN受體相互作用。這些發現導致合乎邏輯的推斷，如果能夠構建所提出的VLS系統，它將不僅與注射局部組織的肌肉細胞或上皮細胞相互作用，還與攜帶ACE2受體或DC-SIGN的先天免疫細胞（例如DCs和巨噬細胞）。先前報道了一種可吸入的納米疫苗，其具有仿生冠狀病毒結構，模擬病毒遺傳物質由脂質體包裹，表面裝載有S蛋白的受體結合域（RBDs）作爲“刺突”以模擬病毒結構，表明VLS的可能性。因此，本研究的目的是設計一種VLS顆粒來包裹mRNA分子並裝載蛋白質，並研究其免疫學特性，特別是其通過表面S1蛋白特異性結合到DCs和巨噬細胞上的DC-SIGN來在小鼠模型中引發免疫反應的能力。所獲得的數據表明，通過VLS結構將mRNA特異性地傳遞到DCs的這種策略與常規mRNA疫苗相比具有非常重要的意義。

2.結果

2.1.VLS的特性描述

SARS-CoV-2 mRNA疫苗的早期開發中一個重要的技術基礎是通過靜電吸引和氫鍵將mRNA分子與陽離子脂質結合，這導致了mRNA分子被LNPs包裹。在我們的VLS設計中，需要一個脂質載體來包裹mRNA，並裝載表面蛋白，這可能需要更大的陽離子脂質電荷容量以在離子環境中進行電荷複合。爲了使脂質顆粒同時攜帶mRNA和蛋白的能力更強，我們的設計包括了兩種陽離子脂質分子，((2-(2-羥乙氧基)乙基)氮雜二基)雙(己烷-6,1-二基)雙(2-己基癸酸酯)和1,2-二油酰-3-三甲基銨丙烷；一種中心磷脂，1,2-二油酰-磷脂酰膽鹼；以及一種聚聚乙二醇(PEG)分子，甲氧基聚(乙二醇)-N-十四烷基十四酰胺-1-2k。通過微流控工藝生產了這種脂質組成和編碼SARS-CoV-2 XBB.1株S1蛋白的mRNA的LNP（補充圖1a）。這些特徵粒子的結構參數（擴展數據表1）和與脂質定量相關的識別mRNA分子（補充圖1a）表明了mRNA疫苗的典型特徵。此外，這種LNP能夠以劑量依賴性的方式將其包裹的mRNA傳遞到293細胞中（圖1a,b）。此外，表達並純化的S1重組蛋白（補充圖1a）被裝載在包裹mRNA的脂質顆粒上，以構建具有與mRNA疫苗相似結構特徵的VLSs（擴展數據表1）。我們的電子顯微鏡觀察表明裝載過程是不可逆的（補充圖1b），並且這種VLS的形態特徵顯示，與單獨包裹mRNA的LNP相比，粒子表面有一些凸起，存在差異（圖1c）。添加S抗體可以通過抗體橋使顆粒聚集（圖1c）。通過免疫沉澱法對VLSs進行結構分析，使用特定的S抗體表明，沉澱的VLS顆粒含有mRNA分子和S1蛋白（圖1d）。這些數據支持在我們的設計模型中使用VLS顆粒。

圖1 | VLS和LNP的特徵。a，熒光顯微鏡顯示LNP、包裹GFP mRNA的LNP和VLS中GFP表達顯著。比例尺，250微米。b，通過西方印跡分析檢測293T細胞轉染LNPs或VLSs 48小時後的S1蛋白。左圖：與LNPs相比，293T細胞轉染EGFP或S1 mRNA後的S1蛋白表達；右圖：轉染不同劑量S1 mRNA的VLSs後，293T細胞中S1蛋白的表達。GAPDH作爲蛋白裝載對照。西方印跡上信號的強度（條帶上方）通過ImageJ（版本1.8.0.112）進行密度分析定量。c，LNPs、包裹S1 mRNA的LNPs、VLS和用特定抗S1抗體處理的VLSs的電子顯微鏡圖像。比例尺，200納米。a-c中的實驗均重複了兩次。d，總樣品、滲透和洗脫中的蛋白（S1或N）和mRNA含量。“IP-S1”表示樣品在與特定抗S1抗體孵育過夜後進行了測試，“IP-N”表示樣品與抗N抗體孵育。實驗裝載量相等，並通過西方印跡和SDS-PAGE銀染（Input）鑑定。數據以三個獨立實驗的平均值±標準差表示。

2.2.VLSs使細胞轉染並靶向ACE2/DC-SIGN分子

與mRNA疫苗的LNPs相比，當蛋白裝載在表面時，VLSs提高了mRNA的傳遞能力。S1蛋白與ACE2或DC-SIGN分子的結合可能導致VLSs靶向局部組織中具有這兩種受體的細胞。我們的研究表明，VLSs不僅能高效轉染293細胞（圖2a），而且還能增強16HBE細胞培養中的mRNA表達，這不僅顯示了目標mRNA的拷貝數（圖2b），而且還表達了蛋白質（圖2a），並且在添加針對S或ACE2的抗體後呈現恢復（圖2c,d）。THP-1細胞也是如此（圖2a,b）。基於我們對大約16HBE細胞表達ACE2和THP-1細胞表達ACE2/DC-SIGN的識別數據（補充圖2），兩種細胞系中mRNA表達的增強可能是由於ACE2或DC-SIGN與S1蛋白的相互作用介導的。此外，用針對DC-SIGN的特定抗體處理THP-1細胞也干擾了VLS mRNA的表達（圖2c,d）。這表明VLSs能夠通過S1與ACE2和DC-SIGN受體的相互作用，將mRNA傳遞到人類巨噬細胞中，這與報告的數據一致。此外，表達DC-SIGN的小鼠DCs（JASWIIs）被發現與S1蛋白相互作用（補充圖3a）。這些細胞與VLS包裹的EGF或S1 mRNA的轉染導致了明顯比單獨轉染LNP包裹的mRNA更大的mRNA表達，因爲針對S或DC-SIGN的特定抗體的阻斷消除了這種效應（圖2c,d和補充圖3c）。使用表達DC-SIGN的小鼠RAW264.7巨噬細胞的相同實驗也提供了類似的結果（圖2c和補充圖3b）。基於先前確認的數據，顯示人類DCs和巨噬細胞由於表達ACE2/DC-SIGN而被SARS-CoV-2感染，我們的結果表明，VLS與ACE2或DC-SIGN受體的相互作用可能參與了先天免疫的激活。

圖2 | VLS通過S1蛋白靶向ACE2/DC-SIGN分子增強細胞轉染，實現mRNA傳遞。a，不同細胞中S1蛋白的表達通過西方印跡進行檢測。c，使用不同細胞的受體或S1（N）蛋白的抗體阻斷後，通過西方印跡檢測VLSs中S1蛋白的表達。LNPs和包裹S1 mRNA的VLSs與293T細胞、16HBE細胞、THP-1細胞、DCs和RAW264.7細胞共孵育。a和c中的實驗均重複了兩次。b，通過qRT-PCR評估轉染到不同細胞的mRNA拷貝數。d，使用細胞受體的抗體阻斷或S1（N）蛋白的抗體阻斷後，通過qRT-PCR評估轉染到細胞的mRNA拷貝數。b、d中，n=3個獨立樣本，均值±標準差。黃色框架中的藍色文本顯示了不同抗體處理的樣本或細胞。顯著性差異是通過單因素方差分析（ANOVA）和Tukey的事後檢驗確定的。

2.3.VLSs與DCs和巨噬細胞的相互作用

先前的數據表明，LNPs對mRNA疫苗在細胞中誘導的強烈轉錄反應是由於LNPs引起的外源性損傷，被認爲是mRNA疫苗的不良反應。我們研究了是否可以通過S1蛋白與受體的結合來降低我們VLS的活性。在我們的研究中，用VLSs處理的16HBE細胞中具有免疫激活作用的一些分子的表達傾向於增加（圖3a），在THP-1細胞中檢測到免疫調節因子的表達增加和炎症介質如腫瘤壞死因子（TNF）的表達減少（圖3b）。此外，在小鼠DCs的JAWSII菌株中，包括TNF和GATA-3在內的分子表達傾向於減少，而干擾素（IFN）家族成員的表達傾向於增加（圖3c）。在RAW264.7小鼠巨噬細胞中觀察到免疫調節因子和炎症因子的轉錄概況輕微且平衡的上調（圖3d）。有趣的是，上皮細胞中干擾素家族成員的上調錶達與DCs和巨噬細胞中的相似（圖3a,c）。這些結果表明VLSs在先天免疫中具有某種免疫激活作用，這與mRNA/LNPs不同，並支持我們的假設，即S1蛋白對VLS表面的影響不僅可以導致mRNA傳遞，還可以激活DC中的DC-SIGN信號通路。

圖3 | LNPs和VLSs轉染細胞的免疫基因轉錄。a-d，16HBE（a）、THP-1（b）、JASWII DC（c）和RAW264.7（d）細胞在轉染只包裹S1 mRNA的LNPs或同時包裹S1 mRNA和S1蛋白的VLSs後24小時的免疫反應相關主要基因的表達譜。藍色代表只包裹S1 mRNA的LNPs，黑色代表VLSs。數據以三個獨立實驗（n=3）的平均值±標準差表示。顯著性差異通過單因素方差分析（ANOVA）和Tukey的事後檢驗確定。

2.4.用VLSs對小鼠進行免疫接種引發免疫信號傳導的差異

我們對VLSs與免疫系統之間的相互作用的研究表明，無論VLS中包裹的mRNA編碼GFP還是S1蛋白，它都在局部組織中動態表達（補充圖4），類似於mRNA疫苗的報告。有趣的是，VLS組小鼠局部組織中S1抗原與DCs或巨噬細胞的共定位率大於mRNA或單獨蛋白組小鼠（圖4a和補充圖5a,b）。在初次免疫後3-7天，VLS組小鼠脾臟中CD86+ DCs與CD83+ DCs的比率，這表明由Toll樣受體（TLR）信號刺激的DCs的成熟度，大於mRNA或蛋白組小鼠（圖4b）。

脾臟中特定CD4+與CD8+記憶T細胞的比率在增強型VLS組以及接受用VLS預處理的DCs組中也大於其他兩組（圖4c,d），這表明VLSs通過S1蛋白特異性結合到DC-SIGN受體與小鼠DCs的相互作用，隨後mRNA的有效表達增強了DCs的活化效率，隨後激活T細胞是顯著的。進一步的抗體測量顯示，在注射後第21天，接受用VLS預處理的DCs的小鼠的抗體滴度大於接受用mRNA或蛋白疫苗預處理的DCs的小鼠（圖4e）。在免疫後24至48小時，對接種實驗VLS疫苗的小鼠局部組織中各種重要免疫分子的轉錄水平進行後續分析，發現與單獨用mRNA或蛋白免疫的小鼠相比，與DCs和巨噬細胞活化直接相關的一些功能分子的表達增加，如CXCL10和MHCI（圖4f）。CXCL10的千倍增加表明，由VLSs激活的DCs可以被分類爲cDCs21。進一步對接種免疫的小鼠脾臟中收集的淋巴細胞在免疫後不同時間點進行的京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）同源轉錄組分析顯示，與mRNA和蛋白組相比，VLS組顯示出特徵性的動態輪廓（圖4g）。所有轉錄輪廓的變化表明，接種VLSs和mRNA或蛋白的個體宿主免疫反應存在差異。

圖4 | VLSs在小鼠中誘導了先天免疫反應。a，代表性共定位率顯示，與肌肉注射VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs的小鼠相比，在24小時和48小時後S1表達與DCs/巨噬細胞在肌肉中的情況。b，小鼠在免疫後3天和7天，脾臟中CD86+與CD83+ DCs的比率，這些小鼠接受了VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs的免疫。c，d，在接受加強和DC處理的輸血VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs後，特異性記憶T細胞（c）和活化T細胞（d）中帶有CD8標記分子的比率。e，在不同處理組DCs輸血後第21天的小鼠抗體滴度。f，小鼠肌肉注射VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs後24小時和48小時，與炎症和先天免疫反應相關的主要基因表達譜。g，在初次免疫後7天、14天和28天以及加強免疫後21天，與免疫調節的激活或分化、細胞過程、信號轉導和炎症相關的主要基因表達譜的淋巴結。顏色條代表與LNP組數值相比的log2（倍數變化）。顏色越紅，基因轉錄水平上調越明顯。組織中炎症細胞因子的相對錶達水平通過比較Ct（ΔΔCt）法歸一化至空白對照組（LNP）的水平。數據以三個獨立實驗（n=3）的平均值±標準差表示。顯著性差異通過單因素方差分析（ANOVA）和Tukey的事後檢驗確定。

2.5.VLSs在小鼠中引發更強的免疫反應

基於對我們的VLS疫苗和當前在人羣中使用的mRNA疫苗（III期臨牀試驗）（18歲以上）（補充圖6）的分析差異，我們的免疫學數據表明，與mRNA或蛋白疫苗中mRNA和蛋白含量相等的VLSs在接種的BALB/c小鼠中引發強大的免疫反應，接種後對Omicron株S抗原的結合抗體水平遠高於單獨接種mRNA或蛋白的小鼠；高水平維持了八個月以上（圖5a），並且小鼠對武漢、Beta和Delta株的S抗原表現出明顯的反應性，水平略低（圖5b）。使用假病毒和真病毒同步檢測變異株的中和抗體也顯示了類似的結果（圖5c），其中對變異株的中和抗體達到了高於1:103的水平，這在先前對動物和人類的免疫保護研究中被確認爲有效。對武漢、Omicron和XBB.1株的RBD的抗體水平在VLS組中大於其他兩組（圖5d）。與其他兩組相比，接種VLS後，尤其是加強免疫後，VLS組小鼠在上呼吸道和血清中分泌的IgA水平增加（圖5e）。此外，比較VLS組和mRNA組小鼠淋巴結中活化B細胞的比率表明，VLS組中活化B細胞的比率大於mRNA組（圖5f）。重要的是，針對IFNγ和白介素-4（IL-4）的ELISpot檢測顯示，在免疫後第90天，VLS組的T細胞反應比mRNA和蛋白組更強烈（圖5g）。由於觀察到IL-4反應的明顯加強，同時對這些小鼠的血清中的多種細胞因子進行了檢測，結果表明VLS組的大多數細胞因子水平低於mRNA或蛋白組（圖5h）。所有數據表明，VLSs引發的免疫反應應與基於VLSs對先天免疫的已知激活效應的mRNAs或蛋白質引發的免疫反應不同。

圖5 | VLSs在小鼠中誘導了適應性免疫反應。a,b, 由VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs在小鼠中誘導產生的針對Omicron（a）和野生型（WT）、Beta和Delta（b）株的SARS-CoV-2特異性抗體滴度。樣本在初次注射後的第35、49、120、180和240天獲取。c, 由VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs在小鼠中誘導產生的針對Omicron真實病毒株BA.5和假病毒的中和抗體（NAb）滴度。d, 由VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs在小鼠中誘導產生的針對Omicron株、XBB.1株和WT株RBD的IgG抗體滴度。e, 由VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs在小鼠中誘導產生的針對Omicron株刺突蛋白的IgA抗體滴度，在免疫後的第21和49天在小鼠BALF（支氣管肺泡灌洗液）和血清中。f, 觀察到的經VLS和mRNA疫苗處理的小鼠淋巴結中的活化B細胞。g, 在初次免疫後第49天，經肌肉注射VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs的小鼠的IFNγ和IL-4的ELISpot反應。橙色框架代表包裹5、10、20和40μg S1 mRNA的LNPs，從淺到深；藍色邊框代表5、10、20和30μg S1肽；藍色邊框中的橙色框架從淺到深代表不同劑量的RNA和肽的不同組合的LNPs。SFC，形成斑點的細胞。h, 加強免疫後第28天，用VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs免疫的小鼠血清中的細胞因子。所有測定值都通過減去空白小鼠血清中檢測到的值來計算。數據以三個獨立實驗（n=3）的平均值±標準差表示。顯著性差異通過單因素方差分析（ANOVA）和Tukey的事後檢驗確定。

2.6.VLSs在ACE+/+小鼠中引發的有效免疫保護

在我們的病毒挑戰測試中，涉及ACE+/+小鼠和倉鼠（補充圖7），結果表明VLSs完全保護了挑戰的小鼠免受Omicron BA.5株、XBB.1和武漢株的侵害，因爲沒有觀察到症狀（擴展數據表2）。在感染期間，在小鼠的各個器官中檢測到很少或沒有病毒複製（圖6a,b和補充圖8-10），並且沒有檢測到組織病理學變化（擴展數據表3）。值得注意的是，在與VLS陰性小鼠相比，用XBB.1挑戰的VLS免疫小鼠的主要器官中沒有檢測到活病毒（圖6c）。此外，對BA.5挑戰的小鼠的淋巴細胞在第3天進行了轉錄組分析。結果表明，與功能反應相關的差異表達基因與免疫系統在VLS組明顯不同於其他兩組（圖6d）。B細胞、CD4+細胞和CD8+細胞的分類表明，更多的DEGs百分比集中在CD4+細胞和B細胞羣體中（圖6d）。這些基因主要是與淋巴細胞增殖相關的轉錄調節分子。結合ACE+/+小鼠VLS組中出色的免疫保護效果，這種獨特的轉錄組輪廓表明，通過VLSs與DCs的穩健結合，通過系統激活DCs在VLS刺激下基於不同信號的整合效應引發的免疫學結果。

圖6 | VLSs對C57-hACE+/+小鼠中Omicron BA.5和XBB.1株挑戰的影響。a, 在Omicron BA.5株感染後，通過RT-qPCR測定了肌肉注射VLS、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs的hACE+/+小鼠在肺、大腦和脊髓中的病毒載量。b,c, 在Omicron XBB.1株感染後，通過RT-qPCR測定了肌肉注射VLS和LNPs的hACE+/+小鼠在大腦、肺、淋巴、氣管和脊髓中的病毒載量（b），並通過病毒斑點形成測定了病毒滴度（c）。基線是根據未感染的陰性小鼠中檢測到的值定義的。FFU，聚焦形成單位；dpi，感染後天數。d, 在Omicron BA.5株感染後3天，從小鼠肌肉注射VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs的淋巴結組織中分離的CD8+ T、CD4+ T和B細胞的激活或分化相關的顯著差異表達基因。顏色條代表與LNP組相比的log2（倍數變化）。顏色越紅，表示基因轉錄水平上調越明顯。數據以三個獨立實驗（n=3）的平均值±標準差表示。顯著性差異通過單因素方差分析（ANOVA）和Tukey的事後檢驗確定。

3.討論

在過去幾年的COVID-19大流行期間，mRNA疫苗爲我們提供了新的疫苗研究技術和疫苗設計和開發的新思路。這種技術方法誘導了對傳染因子的生物學模仿，併爲下一代COVID-19疫苗的開發提供了新的可能性。基於這一進展，我們的工作建立了一個改進的脂質系統，擴大了抗原攜帶能力，包括mRNA和蛋白。這個系統依賴於由兩種陽離子脂質、一種中心磷脂和一種聚-PEG分子組裝成的專門脂質顆粒的結構，該結構由mRNA和病毒蛋白組成。這種脂質系統能夠有效地包裹編碼S1抗原的mRNA，並在其表面攜帶S1蛋白。此外，我們的結果揭示了表面S1蛋白能夠與ACE2/DC-SIGN受體結合，促進mRNA進入細胞並增加抗原表達，除了通過LNP融合到細胞膜的表達之外。因此，我們進一步表明，VLS表面S1蛋白在引導mRNA/LNPs靶向DCs和巨噬細胞方面發揮重要作用，這導致免疫系統對抗原的攝取顯著增加。對這些細胞的轉錄概況的進一步分析表明，VLS能夠以平衡的方式激發多種免疫調節因子和炎症介質的表達的一般趨勢與mRNA/LNPs不同，這表明了VLS作爲疫苗免疫原的重要性。這種設計通過體內免疫學分析進一步得到驗證；我們觀察到在接種VLS的個體的局部組織中，S1抗原與DCs或巨噬細胞的共定位程度更高，以及在接種VLS的個體的淋巴器官中活化DCs羣體的百分比更高，與接種mRNA/LNPs的個體相比。進一步使用體外用VLS預處理的DCs的BALB/c小鼠進行的調查揭示了VLS組中活化T細胞的比例比mRNA疫苗組更高。重要的是，接種VLS的小鼠表現出比接種mRNA/LNPs的小鼠更強烈的抗體反應和更強的細胞毒性T淋巴細胞反應。有趣的是，檢測到了從上呼吸道和血清中分泌的特異性IgA。基於進一步的保護性動物測試，我們發現這種增強的免疫力爲對抗Omicron BA.5、XBB.1或武漢株提供了更有效的保護。進一步的調查揭示了在VLS組的ACE+/+小鼠在挑戰時CD4+細胞羣體中大多數基因的系統上調和B細胞和CD8+細胞羣體中50%以上基因的上調的差異。這些發現表明，接種VLS的小鼠具有特徵性的系統性免疫反應，可能因爲來自先天免疫系統的多種信號的綜合效應。這些數據支持我們的推測，即VLSs能夠與各種細胞相互作用，這不僅導致mRNA的內源性抗原蛋白表達和細胞內TLRs26識別的mRNA分子，而且還有DCs的不同亞羣的質膜中的其他TLRs27識別外源性S1蛋白，類似於與DC-SIGN或ACE2的結合。此外，通過脂質融合轉染VLSs的上皮細胞的抗原趨化效應使DCs激活以攝取抗原併產生一定的抗原信號。在VLS免疫期間引發的這些事件可能導致不同亞羣的DCs和巨噬細胞對T細胞和B細胞的抗原交叉呈遞，並可能導致對VLS免疫的強烈免疫反應（擴展數據圖1）。因此，我們假設基於在DCs和巨噬細胞中特異性誘導mRNA表達的策略可能有助於開發病毒樣疫苗候選物，使其能夠引發綜合免疫反應，以提供比當前COVID-19 mRNA疫苗更有效的針對病毒變種的保護。

然而，這項研究缺乏足夠的數據來解釋VLSs的物理化學結構以及它們與細胞（特別是DCs或巨噬細胞）的相互作用機制、在這些細胞中引發的信號以及VLS免疫個體的系統免疫學過程，這值得進一步深入研究。

4.方法

4.1.倫理聲明

四周至五週齡的K18-hACE2 C57BL/6小鼠（人類ACE2基因敲入C57BL/6小鼠）由Cyagen Biosciences提供（動物許可證號碼SCXK (Su) 2022-0016）。BALB/c小鼠和七至八週齡的金黃倉鼠從Vital River購買（動物許可證號碼SCXK (Jing) 2021-0006和SCXK (Jing) 2021-0011）。所有動物都在特定病原體自由的隔離設施中飼養（實驗室許可證號碼SYXK (Lu) 2020-0019）。實驗動物的照顧和使用遵循“3R”原則和動物福利指南。動物實驗過程及與動物相關的護理和福利已經山東威高利彤生物製品有限公司的動物實驗倫理委員會審查和批准（批准號碼LACUC-RD3-2022-006）。

4.2.細胞系

HEK-293T和16HBE細胞在含有10%胎牛血清（FBS；HyClone，GE Healthcare）、100 U/ml青黴素和100 mg/ml鏈黴素的Dulbecco改良Eagle培養基（DMEM，Thermo Fisher Scientific）中培養。JASWII樹突狀細胞在含有20% FBS和5 ng/ml小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（HY-P7361，MCE）的MEM Alpha（Thermo Fisher Scientific）中培養。RAW264.7細胞在含有10% FBS的最小Eagle培養基（MEM；Thermo Fisher Scientific）中培養。THP-1細胞在含有10% FBS和0.05 mM β-巰基乙醇（M917637，Macklin）的RPMI 1640（Thermo Fisher Scientific）中培養。所有細胞均從ATCC購買，並在37℃、5% CO2條件下維持。

4.3.病毒

新型冠狀病Omicron BA.5株（H株）於2022年12月從COVID-19患者中分離出來。完整的基因組序列已上傳至NCBI GenBank（OQ179919.1）。新型冠狀病KMS-2株（武漢）於2020年2月從雲南省傳染病醫院的COVID-19患者中分離出來。

4.4.動物實驗設計

C57BL/6-ACE2（BALB/c或金黃倉鼠）小鼠被隨機分爲五組（補充圖7）。

擴展數據圖7| 推測的VLS疫苗與宿主免疫系統相互作用並引發小鼠免疫反應的機制。➀ 注射的VLS疫苗被上皮細胞內吞。從內體逃逸並進入細胞質後，mRNA在覈糖體中被翻譯成蛋白質。翻譯後的抗原蛋白可分泌到細胞外空間。DCs和巨噬細胞可被VLS引起的局部炎症所吸引。分泌的抗原和VLS疫苗表面的抗原均可被招募的DCs和巨噬細胞攝取，隨後激活並呈遞給Tfh/Th1和B細胞。➁ 注射的VLS疫苗通過S1蛋白特異性結合DC-SIGN或ACE2受體介導，被DCs和巨噬細胞內吞。傳遞的mRNA被翻譯成內源性抗原，可激活DCs和巨噬細胞。這些激活的免疫細胞能夠將抗原呈遞給Tfh/Th1和B細胞，以激活特異性免疫反應和B細胞的特異性增殖，產生抗體反應，同時引發特異性CTL反應。➂ VLS疫苗表面的S1蛋白抗原作爲外源性抗原，被DCs和巨噬細胞識別和內吞，隨後激活並呈遞給Tfh/Th1和B細胞。這些途徑的所有抗原信號都能激活並增強特異性免疫反應。

在A組（免疫實驗組，n=35），C57BL/6-hACE2小鼠被分爲四組：對照組、VLS組、mRNA組和肽組。VLS包含20μg mRNA和10μg蛋白；mRNA組小鼠接種20μg mRNA，肽組小鼠接種10μg蛋白。所有小鼠在初次免疫後的第21天進行加強免疫。在初次免疫後的24、48和72小時，從免疫部位獲取組織，進行qRT-PCR測量細胞因子表達的免疫熒光檢測。此外，在初次免疫後的3、7和14天以及加強免疫後的28天，從淋巴結中分離出B細胞、CD4+ T細胞和CD8+ T細胞，進行轉錄組測序。

在B組（免疫實驗組，n=36），C57BL/6-hACE2小鼠被分爲三組：對照組、VLS組和mRNA組。用於探索mRNA分子與傳遞系統的組織部位的mRNA。在肌肉注射後的第1、3、5和7天收集心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺、大腦和淋巴結，進行組織免疫熒光檢測。

在C組（免疫實驗組，n=72），BALB/c小鼠被分爲12組：N1-N12。N1-N4爲mRNA疫苗組，N5-N8爲VLS疫苗組，N9-N12爲肽疫苗組。N1-N4分別包含5、10、20和40μg mRNA。N5-N8包含5μg mRNA和5μg肽、10μg mRNA和5μg肽、10μg mRNA和10μg肽、20μg mRNA和10μg肽。N9-N12分別包含5μg、10μg、20μg和30μg肽。所有小鼠在初次免疫後的第21天進行加強免疫。在免疫後的第35、49、120、180和240天，從尾靜脈採集血液樣本進行抗體檢測。加強免疫後的第28天，收集血液進行中和抗體和結合抗體測試，脾臟進行淋巴細胞分離和ELISpot檢測。同時，比較SARS-CoV-2疫苗的免疫滴度。

在D組（免疫保護實驗組；C57BL/6-hACE2，n=75；金黃倉鼠，n=40），加強免疫後的第28天，對照組、VLS組、mRNA組和肽組小鼠分別通過鼻內途徑用SARS-CoV-2 Omicron BA.5（10^4.5 50%細胞培養感染劑量（CCID50））、SARS-CoV-2野生型（10^4 CCID50）或SARS-CoV-2 Omicron XBB.1（10^4.5 CCID50）進行挑戰。在病毒感染後的第3、5和7天收集心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺、氣管、大腦、脊髓、淋巴結和性器官，進行病毒載量定量。同時，在挑戰後第3天，從C57BL/6-hACE2小鼠的淋巴結中分離出B細胞、CD4+ T細胞和CD8+ T細胞，進行轉錄組測序。

在E組（輸血實驗，n=27），DCs用LNPs-肽、LNPs-mRNA和VLSs處理12小時。體外處理的DCs（每隻小鼠3×10^5個細胞）通過尾靜脈輸注到小鼠體內。在移植後的第3和5天獲取脾臟和腹股溝淋巴結，進行流式細胞術和qRT-PCR。輸血後21天測量抗體滴度。上述動物挑戰實驗由武漢生物製品研究所委託進行。

4.5.LNP傳遞系統的合成和配方

根據((2-(2-羥乙氧基)乙基)氮雜二基)雙(己烷-6,1-二基)雙(2-己基癸酸酯)、1,2-二油酰-3-三甲基銨丙烷、1,2-二油酰-磷脂酰膽鹼和甲氧基聚(乙二醇)-N-十四烷基十四酰胺-1-2k的分子量，分別在絕對乙醇（優級試劑）中溶解至20%、10%、20%和10%的分子濃度。所有四個組分以30.68:6.84:15.2:1的摩爾比在乙醇中混合，以準備LNP傳遞系統。mRNA根據請求比例在20 mM醋酸鈉、2.5 mM KCl和0.1%海藻糖的緩衝液中稀釋。通過NanoAssemblr Ignite+ LNPs（Precision Nanosystems）將空白LNPs與mRNA以1:3的重量比混合製備LNP-mRNA。脂質顆粒進一步通過Zetasizer Ultra光譜儀進行表徵。

4.6.SARS-CoV-2 S1 mRNA的合成

通過PCR技術將SARS-CoV-2的S1序列擴增並插入到PVAX載體中。將黃熱病病毒的5′-非翻譯區（UTR）擴增並插入到Kozak序列之前，將人類線粒體核糖體的3′-UTR擴增並插入到S1序列之後，作爲S1序列的5′-UTR和3′-UTR。構建的質粒用BamHI（目錄號R0136V，NEB）在37℃下線性化3小時進行體外轉錄反應。通過體外轉錄反應（HiScribe T7 ARCA mRNA Kit，目錄號E2060S，NEB）合成N1mψ修飾的S1 mRNA。反應混合物用DNase I處理，並使用氯化鋰沉澱進行純化。

4.7.VLS疫苗的製備

通過將LNP-mRNA和肽添加到緩衝液（0.1%海藻糖和3.5%葡萄糖）中，在室溫下以30 r.p.m.混合30分鐘，然後在4℃旋轉混合10 r.p.m.過夜。VLS疫苗進一步通過Zetasizer Ultra光譜儀進行表徵。

4.8.LNP轉染的mRNA和VLS細胞

然後，將0.5、1、2、5和10μg的mRNA通過LNP傳遞系統轉染到293T細胞中，並在轉染後24小時進行西方印跡檢測。同時，將mRNA和VLSs轉染到16HBE、JASWII DCs、THP-1細胞和RAW264.7細胞中，在24小時後進行西方印跡分析和qRT-PCR測量。

4.9.共免疫沉澱

向LNP包裹的mRNA和VLS疫苗（VLS疫苗裝載了BA.1 S1蛋白或N蛋白）中加入抗S1和抗N抗體。然後，加入50μl的磁性珠（BeaverBeads Protein A Matrix Antibody Purification Kit，目錄號20102，蘇州）並孵育30分鐘，在室溫下30 r.p.m.。接下來，在磁場中吸附含磁性珠的樣品2-3分鐘，室溫下，上清液用於mRNA和蛋白含量測量。然後，用洗滌緩衝液洗滌珠，加入洗脫緩衝液進行洗脫，並通過qRT-PCR和ELISA測量mRNA和蛋白含量。

4.10.qRT-PCR

通過qRT-PCR測量VLS和mRNA疫苗中的mRNA含量。根據指南，引物的結合位點設計在SARS-CoV-2 S1基因區域，S1基因的一部分構建在pUC57質粒中。體外轉錄的mRNA用作標準樣品。引物爲F：TGGATCTGGAGGGAAAGCAGGCAACT和R：CCGATTGGCAGATCCACCAGAGGTTC，TaqMan探針（Sangon Biotech）的序列爲5′-6FAM-ATGGCTACTTCAAGATCTATAGCAAGC-TAMRA-3′。通過絕對定量的qPCR確定組織中的病毒載量。根據世界衛生組織的指南，引物的結合位點設計在SARS-CoV-2 N基因區域，N基因構建在pUC57質粒上。引物爲F：GAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCT和R：TTGTTGGCCTTTACCAGACATTTTGCT，TaqMan探針（Sangon Biotech）的序列爲5′-6FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3′。使用RNAiso Plus（T9108，Takara）從組織中提取病毒基因組RNA，使用一步PrimeScript RT-PCR試劑盒（Perfect Real Time）（TaKaRa，代碼RR064A）進行反應。

組織和細胞中細胞因子的相對錶達，使用RNAiso Plus（T9108，Takara）提取總RNA。基因表達以與LNP注射的小鼠或未感染病毒的細胞中的水平的倍數變化（2−∆∆Ct）表示，這些水平用於校準。使用一步SYBR PrimeScript PLUS RT-PCR試劑盒（TakaRa，代碼RR096A）進行反應。使用的具體引物列在擴展數據表4和5中。

4.11.免疫熒光和共聚焦顯微鏡

收集肌肉組織並立即在液氮中冷凍。組織切片嵌入OCT（Tissue-Tek OCT Compound 4583，Sakura）中，並在冰晶切片機上切成5μm厚（CM1850，Leica）。組織切片固定和用5% BSA封閉。檢測病毒抗原時，切片依次用小鼠抗SARS-CoV-2 S抗體（Sino Biological，目錄號40150-V08B1）和Alexa Fluor 647偶聯的山羊抗小鼠IgG二抗（Invitrogen）孵育。使用抗CD11c抗體（Abcam，目錄號ab33483-N418）檢測DCs，使用抗F4/80抗體（Zhengneng，目錄號263101-31B1），Alexa Fluor 488偶聯的山羊抗兔IgG二抗和647偶聯的山羊抗小鼠IgG二抗（Invitrogen）檢測巨噬細胞。所有細胞核均使用4,6-二氨二苯吲哚檢測，並使用共聚焦顯微鏡（TCS SP2，Leica）分析。

4.12.病毒滴定

病毒滴度通過斑點測定法確定，按照標準協議進行，如前所述。簡而言之，病毒經過梯度稀釋並加入六孔板。羧甲基纖維素用作液體覆蓋的基質，結晶紫用作染色以增強斑點可視化，細胞在37℃、5% CO2條件下培養7天。

4.13.中和試驗

簡而言之，血清在56℃下滅活30分鐘，連續稀釋1:4，並與病毒以100倍CCID50/100μl的滴度混合，在37℃下孵育2小時。混合物加入六孔板，並使用羧甲基纖維素作爲基質，結晶紫用作染色以在37℃、5% CO2條件下培養後增強斑點可視化。同時，測量假病毒的血清中和滴度，50%抑制稀釋（EC50）定義爲血清稀釋度，與病毒對照孔（病毒+細胞）相比，相對光單位減少了50%，減去只有細胞的對照組的背景相對光單位。簡而言之，假病毒（Acro，目錄號PSSO-HLC016）與測試樣品的連續稀釋1:64在37℃下孵育1小時，與病毒對照和細胞對照孔一起。然後，將293T-ACE2細胞加入每個孔中。在37℃、5% CO2環境中孵育48小時後，測量發光。

4.14.IFNγ特異性和IL-4特異性ELISpot檢測

對於ELISpot檢測，根據製造商的協議使用小鼠IFNγ和IL-4 ELISpot試劑盒（Mabtech）。簡而言之，用脾淋巴細胞接種板，然後加入3μg的刺激物（XBB Spike RBD蛋白，目錄號40592-V08H144，Sino Biological；B.1.1.529 Spike RBD蛋白，目錄號SPD-C522e，Acro；BA.4/BA.5 Spike RBD蛋白，目錄號SPD-C522R，Acro；BA.2.12.1 Spike RBD蛋白，目錄號SPD-C522q，Acro；BQ.1.1 Spike RBD蛋白，目錄號SPD-C5240，Acro；BA.2.75.2 Spike RBD蛋白，目錄號SPD-C522z，Acro），然後將細胞加入並37℃孵育30小時。接下來，去除細胞和培養基，顯色發展。使用ELISpot閱讀器（Mabtech）計數有色斑點。

4.15.從小鼠淋巴結中分離B細胞、CD4+ T細胞和CD8a+ T細胞

在無菌條件下分離淋巴結並輕輕研磨，將淋巴細胞分離成懸浮液。使用MajoSort小鼠CD19納米珠（目錄號SPD-C522R，Acro 480002，BioLegend）富集B細胞，使用EasySep小鼠CD4+ T細胞分離試劑盒（目錄號SPD-C522R，Acro 19852A，Stemcell）富集CD4+ T細胞，使用EasySep小鼠CD8a+選擇試劑盒（目錄號SPD-C522R，Acro 18953，Stemcell）富集CD8+ T細胞。

4.16.B細胞、CD4+ T細胞和CD8a+ T細胞的轉錄組分析

通過淋巴結分離B細胞、CD4+ T細胞和CD8a+ T細胞。使用TRIzol（目錄號DP421，天根）提取總RNA。使用NanoDrop系統和Bioanalyzer評估RNA數量和完整性，並根據Illumina的說明準備樣品並測序（Gene Denovo Biotechnology）。在京都基因與基因組百科全書分析中，選擇表達變化2倍或更大的基因在P < 0.05，並按功能類別進行分組。所有轉錄組測序結果已上傳至GSA；提交的指定訪問號碼爲CRA010542。

4.17.酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

使用SARS-CoV-2 Spike Protein ELISA Kit（Acro，目錄號RAS-A039）定量S1抗原，並使用SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleoprotein ELISA Kit（Jiya Biotechnology）定量核蛋白。使用SARS-CoV-2 RBD (Wild-Type) Antibody (IgG) Detection Kits（Vazyme，目錄號DD3201-01）、SARS-CoV-2 RBD (Omicron BA.4/5) Antibody (IgG) Detection Kits（Vazyme，目錄號DD3214-01，中國）和Mouse Anti-2019-nCoV (S) IgA Elisa Kits（FineTest，目錄號1906）進行S1-RBD IgG檢測。使用Mouse Anti-SARS-CoV-2 (B.1.1.529) Antibody IgG Titer Serologic Assay Kit (Spike S1)（Acro，目錄號RAS-T061）、Mouse Anti-SARS-CoV-2 Antibody IgG Titer Serologic Assay Kit (Spike S1)（Acro，目錄號RAS-T045）、Mouse Anti-SARS-CoV-2 (B.1.351) Antibody IgG Titer Serologic Assay Kit (Spike S1)（Acro，目錄號RAS-T084）、Mouse Anti-SARS-CoV-2 (B.1.617.2) Antibody IgG Titer Serologic Assay Kit (Spike S1)（Acro，目錄號RAS-T086）進行S1抗體檢測。光密度值至少比陰性對照高2.1倍的血清樣本被視爲陽性。終點滴度定義爲產生陽性光密度值的最高血清稀釋度。幾何平均滴度計算爲每組陽性血清樣本的終點滴度的幾何平均值。

4.18.西方印跡法

蛋白質通過12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離，並轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。膜用5%牛血清白蛋白-三羥甲基氨基甲烷緩衝液與Tween-20（Sigma-Aldrich）封閉，並與抗SARS-CoV-2 S1抗體（MHC0102，雲南樂鵬科技）、抗ACE2抗體（Abcam，目錄號ab15348）和抗DC-SIGN抗體（Santa Cruz Biotechnology，目錄號sc-74589）孵育2小時；洗滌三次，然後用辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗小鼠IgG（H+L）（Sigma）孵育1小時。最後，PVDF膜洗滌三次，用ECL超敏化學發光試劑（NCM Biotech，目錄號P10100）覆蓋，並在Bio-Rad凝膠成像儀上曝光和顯色。

4.19.SDS-PAGE的銀染

用試劑盒（Fast Silver Stain Kit，目錄號P0017S，Beyotime）對製備的SDS-PAGE凝膠進行銀染。SDS-PAGE凝膠的銀染分爲十個步驟：固定、用30%乙醇洗滌、水洗、增感、水洗、銀染、水洗、顯色、終止和水洗。

4.20.流式細胞術分析

在疫苗初次和加強免疫後的第3天和第7天收集淋巴結和脾臟，並分離淋巴細胞。用於檢測DC激活表面標記的流標抗體爲PE/Cy5-CD45（目錄號MA5-38732，Thermo Fisher）、PE/Cy7-CD11c（目錄號A15849，Thermo Fisher）、FITC-CD80（目錄號A14722，Thermo Fisher）、APC-CD83（目錄號ab234119，Abcam）和PE-CD86（目錄號12-0862-82，Thermo Fisher）。用於檢測特定T細胞表面標記的流標抗體爲BV421-CD44（目錄號103019，BioLegend）、APC-CD25（目錄號102011，BioLegend）、PE/Cy5-CD3（目錄號100205，BioLegend）、FITC-CD4（目錄號100405，BioLegend）、APC/Cy7-CD8（目錄號100713，BioLegend）和PE-Tetramer（Helixgen COVID-19 MHC-I Tetramer）。用於檢測活化B細胞表面標記的流標抗體爲FITC-CD19（目錄號115505，BioLegend）、PerCp/Cy5.5-GL7（目錄號144609，BioLegend）和PE-S1（Expedeon，目錄號336-005）。細胞在4℃下染色30分鐘，流式細胞分析（LSR Fortessa，BD）前洗滌兩次。

4.21.Luminex分析

根據製造商的說明進行Bio-Plex Mouse 23-Plex Panel試劑盒（目錄號M60009RDPD）檢測。簡而言之，通過將重組標準品連續稀釋，生成了從1.6到10,000 pg/ml的標準曲線。通過向每個孔中移液200μl的檢測緩衝液來阻斷濾板。10分鐘後，通過真空吸引棄去檢測緩衝液，向指定的樣品孔中加入25μl的檢測稀釋液，向標準品孔中加入RPMI 1640 with GlutaMAX（Gibco）。然後，向相應的孔中加入標準品或樣品，以及25μl的抗體包被的熒光珠子。生物素標記的二抗和鏈親和素-熒光素標記的抗體隨後通過交替孵育和洗滌步驟加入到孔中。然後，向孔中加入100μl的鞘液，立即使用Bio-Plex陣列閱讀器在高和低RP1目標上使用五參數邏輯迴歸曲線進行讀取。

4.22.統計分析和可重複性

對於西方印跡和電子顯微鏡、免疫熒光檢測至少重複兩次；對於ELISA，定量分析至少重複三次。所有數據表示爲均值±標準誤差。組間顯著性差異通過GraphPad Prism進行分析。統計顯著性設爲P < 0.05。

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撰寫| 藥時空

校稿| Gddra編審| Hide / Blue sea

編輯 設計| Alice